乳腺癌（Breast Cancer, BC）在世界范圍內(nèi)是女性患癌的首要類型，占癌癥患者中的25%。
根據(jù)乳腺癌細(xì)胞受體類型，將乳腺癌大致劃分為雌激素陽性ER+，孕激素陽性PR+，人類表皮生長(zhǎng)因子受體2陽性HER2+和三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)。
TNBC主要表現(xiàn)為增殖快、轉(zhuǎn)移早、復(fù)發(fā)率高、缺乏分子靶點(diǎn)治療而預(yù)后較差，是導(dǎo)致TNBC高死亡率的關(guān)鍵因素，因而成為研究者們主要的研究對(duì)象。
文獻(xiàn)來源
山東大學(xué)齊魯醫(yī)院發(fā)表在Molecular Therapy雜志中題為:circ-EIF6 encodes EIF6-224aa to promote TNBC progression via stabilizing MYH9 and activating the Wnt/beta-catenin pathway的研究中，探究了TNBC腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制，即circ-EIF6通過編碼肽段EIF6-224aa，與致癌基因MYH9相互作用，抑制泛素-蛋白酶體途徑進(jìn)而激活Wnt/ β-catenin通路促進(jìn)TNBC進(jìn)展。
circRNA分子研究主要集中在circRNA的“海綿”機(jī)制抑制miRNA表達(dá)及RNA結(jié)合蛋白的支架分子上，可編碼蛋白的環(huán)狀RNA由于其特殊的環(huán)狀特性，能以更穩(wěn)定的方式表達(dá)蛋白質(zhì)，近年來也成為一大研究熱點(diǎn)。
目前已經(jīng)證明了這些環(huán)狀RNA及其蛋白產(chǎn)物在癌癥中的關(guān)鍵作用，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝癌和結(jié)腸癌。然而蛋白質(zhì)編碼環(huán)狀RNA在TNBC中的重要作用尚未被充分研究。
TNBC腫瘤中 circ-EIF6發(fā)現(xiàn)與鑒定
首先，作者利用高通量測(cè)序技術(shù)篩選TNBC腫瘤組織與BC組織中差異表達(dá)的circRNAs，并與231和231_M細(xì)胞水平RNA-seq結(jié)果取交集，證實(shí)有9個(gè)circRNAs顯著差異表達(dá)。
基于一些臨床病理數(shù)據(jù)分析，作者將選定circ-EIF6作為TNBC腫瘤研究的主分子，它的表達(dá)量高低與TNBC腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)，circ-EIF6的高表達(dá)預(yù)示著總生存率的預(yù)后更差。
隨后，通過Sanger測(cè)序，RNase R酶消化，PCR擴(kuò)增，半衰期檢測(cè)等一系列實(shí)驗(yàn)，鑒定circ-EIF6具有頭尾剪接的環(huán)狀特征。利用siRNA沉默circ-EIF6表達(dá)后，抑制了TNBC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，細(xì)胞周期阻滯。
circ-EIF6編碼肽EIF6-224aa
針對(duì)circ-EIF6序列分析發(fā)現(xiàn)包含一段675nt ORF，揭示circ-EIF6可能編碼一個(gè)224 aa的肽，于是編碼蛋白的能力在蔗糖密度梯度離心的多體分析中得到證實(shí)。
此外，通過生物信息學(xué)分析，作者使用雙熒光素酶和雙順反子報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)證明了circ-EIF6中內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）序列活性。IRES序列有著特殊高級(jí)結(jié)構(gòu)，是一段可以與核糖體結(jié)合直接起始翻譯的序列，對(duì)于沒有5’帽結(jié)構(gòu)的circRNA而言，擁有IRES序列也是其有編碼蛋白潛力的必要因素。
進(jìn)一步設(shè)計(jì)circ-EIF6-FLAG檢測(cè)circ-EIF 6編碼的肽，其中Flag序列被分割并克隆在circRNA序列兩側(cè)，Western檢測(cè)到EIF6-224aa-FLAG的表達(dá)，表明circ-EIF6具有蛋白編碼能力。通過LC-MS分析鑒定了EIF6-224aa的特異性肽序列并生產(chǎn)抗體表達(dá)用于后續(xù)EIF6-224aa表達(dá)檢測(cè)。
EIF6-224aa功能和機(jī)制研究
在EIF6-224aa的功能研究中，EIF6-224aa-FLAG和circ-EIF6-OV組均顯著促進(jìn)了TNBC細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力，circ-EIF 6-ATG-mut組與對(duì)照組無顯著差異。相應(yīng)地，體內(nèi)皮下成瘤實(shí)驗(yàn)表明circ-EIF6-OV促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移能力。
(EIF6-224aa而非CIF-EIF6促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移)
為進(jìn)一步探索EIF6-224aa促腫瘤功能的分子機(jī)制，作者通過共免疫共沉淀技術(shù)以確定其與靶分子MYH9的相互作用，且二者共定位于細(xì)胞質(zhì)中。將MYH9蛋白分段截短構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)EIF6-224aa主要與MYH9的第一和第四片段相互作用。
其次使用蛋白合成抑制劑環(huán)己酰胺（CHX）處理，EIF6-224aa的過表達(dá)降低了MYH9的降解速度，也就是說circ-EIF6表達(dá)的內(nèi)源性EIF6-224a保護(hù)MYH9免于降解。聯(lián)合MG132蛋白酶體抑制劑和泛素化檢測(cè)，結(jié)果表明EIF6-224aa過表達(dá)降低了MYH9蛋白的泛素化水平，保護(hù)MYH9蛋白免受蛋白酶體降解。
在EIF6-224aa-FLAG轉(zhuǎn)染TNBC基礎(chǔ)上加si-MYH9，一系列功能實(shí)驗(yàn)表明MYH9干擾拮抗了EIF6-224aa的致癌作用（對(duì)增殖，遷移和侵襲能力的影響）。
研究表明MYH9的表達(dá)與Wnt/β-catenin通路的激活相關(guān)，那么過表達(dá)EIF6-224aa后檢測(cè)β-catenin表達(dá)上調(diào)，而用si-MYH9處理其表達(dá)下調(diào)。下游靶蛋白（cyclin D1、c-Myc、N-cad、E-cad和vimentin）的表達(dá)也發(fā)生了相應(yīng)的變化。這些檢測(cè)證實(shí)了Wnt/β-catenin通路中的靶基因被EIF6-224aa上調(diào)，而MYH9敲除則拮抗EIF6-224aa的作用。
(EIF6-224aa直接與MYH9相互作用 并保護(hù)其免受降解)
(EIF6-224aa通過激活 MYH9/Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)TNBC進(jìn)展)
綜上，circ-EIF6通過編碼新的多肽EIF6-224aa，進(jìn)一步激活MYH9/Wnt/-連環(huán)蛋白通路，顯著增強(qiáng)了TNBC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。
此外，circ-EIF6是TNBC患者潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。新發(fā)現(xiàn)的編碼circ-EIF6拓寬了我們對(duì)TNBC的潛在機(jī)制的見解，并為TNBC患者的治療提供了一個(gè)潛在的預(yù)后和治療靶點(diǎn)。
(circ-EIF6調(diào)節(jié)TNBC增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制示意圖)
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