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中山大學(xué) | 納米脂質(zhì)體可通過焦亡和cGAS-STING活化增強TNBC治療中的抗腫瘤免疫效果
吉滿生物
2024-10-12

研究背景


乳腺癌是世界上最常見的惡性腫瘤,其中三陰性乳腺癌(TNBC)是一種難以治愈的類型,由于缺乏靶向藥物,目前化療仍是TNBC治療的主要手段。


雖然免疫治療策略在治療各種癌癥方面已顯示出令人鼓舞的結(jié)果,然而,TNBC細胞通過降低其免疫原性來逃避宿主免疫系統(tǒng),而免疫原性降低了腫瘤內(nèi)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的浸潤,化療有時可通過釋放損傷相關(guān)的分子模式分子(DAMPs)誘導(dǎo)免疫原性凋亡,增強腫瘤的免疫原性。然而,大多數(shù)化療呈“無聲死亡”過程,導(dǎo)致免疫反應(yīng)微弱。


焦亡是細胞程序性死亡的一種促炎形式,它依賴于Gasdermin N端蛋白形成的質(zhì)膜孔,最終釋放大量的細胞內(nèi)容物并引起有效的免疫應(yīng)答。例如,化療通常通過上調(diào)caspase-3的表達來誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。如果腫瘤細胞表達GSDME, caspase-3可以將GSDME裂解至GSDME-C(GSDME C-末端)和GSDME- N (GSDME N -末端),使非炎性化療誘導(dǎo)的細胞凋亡轉(zhuǎn)化為炎性焦亡,激活抗腫瘤免疫。然而,GSDME在包括TNBC在內(nèi)的許多癌癥中被下調(diào),即使在cleaved caspase-3過表達后也能阻止細胞焦亡。


文獻來源


2023年5月,中山大學(xué)帥心濤課題組在《NANO LETTERS》期刊發(fā)表文章:Nanodrug Augmenting Antitumor Immunity for Enhanced TNBC Therapy via Pyroptosis and cGAS-STING Activation。


該團隊構(gòu)建了一種新型納米脂質(zhì)體(GM@LR),并利用其將表達GSDME的質(zhì)粒和羰基錳(MnCO)共同遞送到TNBC細胞中。在H2O2存在下,MnCO生成Mn2+和一氧化碳(CO)。CO活化的caspase-3切割表達的GSDME,使凋亡轉(zhuǎn)化為焦亡。此外,Mn2+通過激活STING信號通路促進樹突狀細胞(DCs)的成熟。瘤內(nèi)成熟樹突狀細胞比例增加,細胞毒性淋巴細胞大量浸潤,引發(fā)強烈地免疫反應(yīng)從而有效抑制腫瘤的生長。


MnCO/pGSDME納米載體的制備(GM@L)示意圖


納米脂質(zhì)體的特性


經(jīng)測定表明GM@LR在H2O2存在下可以形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物并生成CO。CO可觸發(fā)凋亡通路,納米藥物內(nèi)化后可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。


通過YOYO-1標(biāo)記的pGSDME(綠色)來跟蹤GM@LR通過4T1細胞的內(nèi)在化,結(jié)果顯示內(nèi)化的GYOYO- 1M@LR納米顆粒最初被轉(zhuǎn)運到溶酶體,然后pGSDME被轉(zhuǎn)運到細胞核(圖1H和I)。由于MnCO產(chǎn)生的CO在細胞內(nèi)的積累可以通過促進ROS的生成來誘導(dǎo)細胞凋亡。因此作者通過CLSM和流式細胞儀使用DCFH-DA探針測量細胞內(nèi)ROS水平,GM@LR組處理后的細胞中ROS相關(guān)熒光最強。


圖1  納米藥物的特性及其在細胞中的行為


項目研究


裝載MnCO的納米治療(M@LR和GM@LR)導(dǎo)致4T1細胞活力降低(圖2A)。GM@LR與M@LR相比也沒有增加細胞死亡率,這表明添加pGSDME并不會導(dǎo)致額外的細胞毒性。在MnCO納米藥物處理的4T1細胞中檢測到活化的caspase-3(圖2D)。此外,經(jīng)GM@LR處理的細胞表現(xiàn)出典型的細胞焦亡跡象,即腫脹和細胞膜破裂(紅色箭頭表示),GSDME- N蛋白表達顯著增加。僅在GM@LR處理后的培養(yǎng)基中,乳酸脫氫酶(LDH)水平顯著升高(圖2G),進一步證實了細胞發(fā)生了焦亡。隨后分析了GM@LR治療后HMGB1和ATP水平均顯著增加。


為了監(jiān)測納米藥物對樹突狀細胞成熟的影響,將未成熟的骨髓來源樹突狀細胞(BMDCs)與處理后的4T1細胞的上清液一起培養(yǎng)。GM@LR組成熟DC (CD80+/CD86+)的百分比顯著增加(圖2K),MHC-II表達也顯著上調(diào)(圖3L),即表明DC成熟,抗原呈遞能力增強。如圖2M所示,裝載MnCO納米藥物的BMDCs (M@LR和GM@LR)中,STING水平下調(diào),cGAS和p-IRF3水平明顯上調(diào),表明cGAS-STING信號通路被激活。


以上得出,GM@LR誘導(dǎo)焦亡的4T1細胞釋放大量內(nèi)源性DAMPs(HMGB1和ATP)和上調(diào)CRT,隨著Mn2+激活cGAS-STING信號通路,成熟DCs的比例增加(圖2N)。


圖2  納米藥物的體外細胞毒性、細胞焦亡和STING誘導(dǎo)


當(dāng)原位腫瘤生長到約50mm3時,用不同的制劑(PBS、G@LR、M@LR和GM@LR)處理小鼠,并根據(jù)腫瘤體積和重量評價其抗腫瘤活性。如圖3F?H所示,使用GM@LR治療對腫瘤生長的抑制最大,這與最長的生存期相吻合(圖3I)。此外,GM@LR對Ki67陽性細胞的抑制作用也最為明顯(圖3J)。進一步分析了GSDME-N在腫瘤組織中的表達。GSDME在裝載pGSDME納米藥物的腫瘤中表達(G@LR和GM@LR),而GSDME- N僅在GM@LR組中表達(圖3K)。因此,GM@LR誘導(dǎo)的腫瘤焦亡導(dǎo)致DAMPs暴露,可能導(dǎo)致更強的抗腫瘤作用。


圖3  原位乳腺腫瘤小鼠的抗腫瘤作用


為了進一步證實GM@LR的抗腫瘤作用是一種有效的免疫反應(yīng)的結(jié)果,隨后測量了不同組的腫瘤免疫微環(huán)境。如圖4所示GM@LR組中成熟的TIDC比例最高,對應(yīng)的腫瘤內(nèi)CD8+ T細胞比例也最高。其次,由于Mn2+促進TIDC的成熟,GM@LR誘導(dǎo)的焦亡在腫瘤部位引起了強烈的局部免疫反應(yīng),并轉(zhuǎn)化為顯著的腫瘤消退。通過建立了4T1肺轉(zhuǎn)移模型來證實GM@LR還能激發(fā)抗腫瘤免疫記憶,有效地防止腫瘤轉(zhuǎn)移。


圖4  原位乳腺癌的免疫激活


肝轉(zhuǎn)移是乳腺腫瘤常見的臨床癥狀。作者建立了肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤模型(圖5A)。靜脈注射GM@LR后,MRI T1加權(quán)像(T1WI)增強信號檢測到界限清楚的高信號肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤(圖5B),提示GM@LR可以幫助MRI監(jiān)測轉(zhuǎn)移。術(shù)后3天對肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤小鼠進行治療(圖5C),在GM@LR處理小鼠中檢測到最低的熒光素酶信號,表明這種納米藥物有效地抑制了肝內(nèi)轉(zhuǎn)移性4T1腫瘤的生長。H&E染色也證實了GM@LR對腫瘤抑制最大,細胞凋亡顯著(圖5D)。同時,GM@LR治療可顯著延長了荷瘤小鼠的生存時間(圖5E),CD80+CD86+成熟DC在轉(zhuǎn)移瘤中的比例增加,腫瘤浸潤性CD8+ T細胞增加(圖5F,G),瘤內(nèi)Treg減少(圖5H,I)。總而言之,GM@ LR通過增強免疫反應(yīng)對肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤產(chǎn)生明顯的抑制作用。


圖5  轉(zhuǎn)移性肝腫瘤的抗腫瘤作用


綜上所述,該課題開發(fā)了一種PEG-cRGD修飾脂質(zhì)體,包封MnCO和pGSDME,用于靶向治療TNBC。


PEG-cRGD表面修飾不僅提高了其穩(wěn)定性,而且增強了其靶向腫瘤的能力。在內(nèi)源性高水平H2O2存在的4T1細胞中,被包裹的MnCO分解為Mn2+和CO,導(dǎo)致caspase-3激活?;罨腸aspase-3裂解全長GSDME誘導(dǎo)細胞凋亡,最終釋放出大量的DAMPs。此外,Mn2+通過激活TIDC中的cGAS-STING通路增強了凋亡觸發(fā)的抗腫瘤反應(yīng)。這些協(xié)同作用顯著抑制了原位和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤的生長。


本研究提供了一種可能的策略,通過焦亡和cGAS-STING信號激活誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng),同時結(jié)合免疫治療和MRI診斷。


吉滿助力


本實驗中所用GSDME過表達質(zhì)粒均由吉滿生物構(gòu)建。

了解更多質(zhì)粒構(gòu)建,病毒包裝,穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建,敲除細胞株,報告基因檢測等相關(guān)服務(wù)。歡迎訪問吉滿生物官網(wǎng):zxpdf.cn

免費咨詢電話:400-627-9288




文獻原文

https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c01008


原文引用

“GSDME plasmid and GFP plasmid were established by

Genomeditech (Shanghai, China)Co.,Ltd (Shanghai, China).The mouse GSDME plasmid(gene ID: NM_018769.4) was established by Genomeditech (Shanghai) with the vector pcDNA3.1(+).”

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中山大學(xué) | 納米脂質(zhì)體可通過焦亡和cGAS-STING活化增強TNBC治療中的抗腫瘤免疫效果
吉滿生物
2024-10-12

研究背景


乳腺癌是世界上最常見的惡性腫瘤,其中三陰性乳腺癌(TNBC)是一種難以治愈的類型,由于缺乏靶向藥物,目前化療仍是TNBC治療的主要手段。


雖然免疫治療策略在治療各種癌癥方面已顯示出令人鼓舞的結(jié)果,然而,TNBC細胞通過降低其免疫原性來逃避宿主免疫系統(tǒng),而免疫原性降低了腫瘤內(nèi)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的浸潤,化療有時可通過釋放損傷相關(guān)的分子模式分子(DAMPs)誘導(dǎo)免疫原性凋亡,增強腫瘤的免疫原性。然而,大多數(shù)化療呈“無聲死亡”過程,導(dǎo)致免疫反應(yīng)微弱。


焦亡是細胞程序性死亡的一種促炎形式,它依賴于Gasdermin N端蛋白形成的質(zhì)膜孔,最終釋放大量的細胞內(nèi)容物并引起有效的免疫應(yīng)答。例如,化療通常通過上調(diào)caspase-3的表達來誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。如果腫瘤細胞表達GSDME, caspase-3可以將GSDME裂解至GSDME-C(GSDME C-末端)和GSDME- N (GSDME N -末端),使非炎性化療誘導(dǎo)的細胞凋亡轉(zhuǎn)化為炎性焦亡,激活抗腫瘤免疫。然而,GSDME在包括TNBC在內(nèi)的許多癌癥中被下調(diào),即使在cleaved caspase-3過表達后也能阻止細胞焦亡。


文獻來源


2023年5月,中山大學(xué)帥心濤課題組在《NANO LETTERS》期刊發(fā)表文章:Nanodrug Augmenting Antitumor Immunity for Enhanced TNBC Therapy via Pyroptosis and cGAS-STING Activation。


該團隊構(gòu)建了一種新型納米脂質(zhì)體(GM@LR),并利用其將表達GSDME的質(zhì)粒和羰基錳(MnCO)共同遞送到TNBC細胞中。在H2O2存在下,MnCO生成Mn2+和一氧化碳(CO)。CO活化的caspase-3切割表達的GSDME,使凋亡轉(zhuǎn)化為焦亡。此外,Mn2+通過激活STING信號通路促進樹突狀細胞(DCs)的成熟。瘤內(nèi)成熟樹突狀細胞比例增加,細胞毒性淋巴細胞大量浸潤,引發(fā)強烈地免疫反應(yīng)從而有效抑制腫瘤的生長。


MnCO/pGSDME納米載體的制備(GM@L)示意圖


納米脂質(zhì)體的特性


經(jīng)測定表明GM@LR在H2O2存在下可以形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物并生成CO。CO可觸發(fā)凋亡通路,納米藥物內(nèi)化后可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。


通過YOYO-1標(biāo)記的pGSDME(綠色)來跟蹤GM@LR通過4T1細胞的內(nèi)在化,結(jié)果顯示內(nèi)化的GYOYO- 1M@LR納米顆粒最初被轉(zhuǎn)運到溶酶體,然后pGSDME被轉(zhuǎn)運到細胞核(圖1H和I)。由于MnCO產(chǎn)生的CO在細胞內(nèi)的積累可以通過促進ROS的生成來誘導(dǎo)細胞凋亡。因此作者通過CLSM和流式細胞儀使用DCFH-DA探針測量細胞內(nèi)ROS水平,GM@LR組處理后的細胞中ROS相關(guān)熒光最強。


圖1  納米藥物的特性及其在細胞中的行為


項目研究


裝載MnCO的納米治療(M@LR和GM@LR)導(dǎo)致4T1細胞活力降低(圖2A)。GM@LR與M@LR相比也沒有增加細胞死亡率,這表明添加pGSDME并不會導(dǎo)致額外的細胞毒性。在MnCO納米藥物處理的4T1細胞中檢測到活化的caspase-3(圖2D)。此外,經(jīng)GM@LR處理的細胞表現(xiàn)出典型的細胞焦亡跡象,即腫脹和細胞膜破裂(紅色箭頭表示),GSDME- N蛋白表達顯著增加。僅在GM@LR處理后的培養(yǎng)基中,乳酸脫氫酶(LDH)水平顯著升高(圖2G),進一步證實了細胞發(fā)生了焦亡。隨后分析了GM@LR治療后HMGB1和ATP水平均顯著增加。


為了監(jiān)測納米藥物對樹突狀細胞成熟的影響,將未成熟的骨髓來源樹突狀細胞(BMDCs)與處理后的4T1細胞的上清液一起培養(yǎng)。GM@LR組成熟DC (CD80+/CD86+)的百分比顯著增加(圖2K),MHC-II表達也顯著上調(diào)(圖3L),即表明DC成熟,抗原呈遞能力增強。如圖2M所示,裝載MnCO納米藥物的BMDCs (M@LR和GM@LR)中,STING水平下調(diào),cGAS和p-IRF3水平明顯上調(diào),表明cGAS-STING信號通路被激活。


以上得出,GM@LR誘導(dǎo)焦亡的4T1細胞釋放大量內(nèi)源性DAMPs(HMGB1和ATP)和上調(diào)CRT,隨著Mn2+激活cGAS-STING信號通路,成熟DCs的比例增加(圖2N)。


圖2  納米藥物的體外細胞毒性、細胞焦亡和STING誘導(dǎo)


當(dāng)原位腫瘤生長到約50mm3時,用不同的制劑(PBS、G@LR、M@LR和GM@LR)處理小鼠,并根據(jù)腫瘤體積和重量評價其抗腫瘤活性。如圖3F?H所示,使用GM@LR治療對腫瘤生長的抑制最大,這與最長的生存期相吻合(圖3I)。此外,GM@LR對Ki67陽性細胞的抑制作用也最為明顯(圖3J)。進一步分析了GSDME-N在腫瘤組織中的表達。GSDME在裝載pGSDME納米藥物的腫瘤中表達(G@LR和GM@LR),而GSDME- N僅在GM@LR組中表達(圖3K)。因此,GM@LR誘導(dǎo)的腫瘤焦亡導(dǎo)致DAMPs暴露,可能導(dǎo)致更強的抗腫瘤作用。


圖3  原位乳腺腫瘤小鼠的抗腫瘤作用


為了進一步證實GM@LR的抗腫瘤作用是一種有效的免疫反應(yīng)的結(jié)果,隨后測量了不同組的腫瘤免疫微環(huán)境。如圖4所示GM@LR組中成熟的TIDC比例最高,對應(yīng)的腫瘤內(nèi)CD8+ T細胞比例也最高。其次,由于Mn2+促進TIDC的成熟,GM@LR誘導(dǎo)的焦亡在腫瘤部位引起了強烈的局部免疫反應(yīng),并轉(zhuǎn)化為顯著的腫瘤消退。通過建立了4T1肺轉(zhuǎn)移模型來證實GM@LR還能激發(fā)抗腫瘤免疫記憶,有效地防止腫瘤轉(zhuǎn)移。


圖4  原位乳腺癌的免疫激活


肝轉(zhuǎn)移是乳腺腫瘤常見的臨床癥狀。作者建立了肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤模型(圖5A)。靜脈注射GM@LR后,MRI T1加權(quán)像(T1WI)增強信號檢測到界限清楚的高信號肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤(圖5B),提示GM@LR可以幫助MRI監(jiān)測轉(zhuǎn)移。術(shù)后3天對肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤小鼠進行治療(圖5C),在GM@LR處理小鼠中檢測到最低的熒光素酶信號,表明這種納米藥物有效地抑制了肝內(nèi)轉(zhuǎn)移性4T1腫瘤的生長。H&E染色也證實了GM@LR對腫瘤抑制最大,細胞凋亡顯著(圖5D)。同時,GM@LR治療可顯著延長了荷瘤小鼠的生存時間(圖5E),CD80+CD86+成熟DC在轉(zhuǎn)移瘤中的比例增加,腫瘤浸潤性CD8+ T細胞增加(圖5F,G),瘤內(nèi)Treg減少(圖5H,I)。總而言之,GM@ LR通過增強免疫反應(yīng)對肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤產(chǎn)生明顯的抑制作用。


圖5  轉(zhuǎn)移性肝腫瘤的抗腫瘤作用


綜上所述,該課題開發(fā)了一種PEG-cRGD修飾脂質(zhì)體,包封MnCO和pGSDME,用于靶向治療TNBC。


PEG-cRGD表面修飾不僅提高了其穩(wěn)定性,而且增強了其靶向腫瘤的能力。在內(nèi)源性高水平H2O2存在的4T1細胞中,被包裹的MnCO分解為Mn2+和CO,導(dǎo)致caspase-3激活?;罨腸aspase-3裂解全長GSDME誘導(dǎo)細胞凋亡,最終釋放出大量的DAMPs。此外,Mn2+通過激活TIDC中的cGAS-STING通路增強了凋亡觸發(fā)的抗腫瘤反應(yīng)。這些協(xié)同作用顯著抑制了原位和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤的生長。


本研究提供了一種可能的策略,通過焦亡和cGAS-STING信號激活誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng),同時結(jié)合免疫治療和MRI診斷。


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本實驗中所用GSDME過表達質(zhì)粒均由吉滿生物構(gòu)建。

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文獻原文

https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c01008


原文引用

“GSDME plasmid and GFP plasmid were established by

Genomeditech (Shanghai, China)Co.,Ltd (Shanghai, China).The mouse GSDME plasmid(gene ID: NM_018769.4) was established by Genomeditech (Shanghai) with the vector pcDNA3.1(+).”

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