文獻(xiàn)來源
2023年7月12日，吉林大學(xué)賴良學(xué)、李占軍團(tuán)隊(duì)在BMC biology上發(fā)表“A new compact adenine base editor generated through deletion of HNH and REC2 domain of SpCas9”的研究論文。
該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)ABE8e可以容忍SpCas9的REC2(Δ174-296)和HNH(Δ786-855)結(jié)構(gòu)域中的大的單個(gè)缺失，并且這些缺失可以堆疊在一起以創(chuàng)建新的sABE。sABE 顯示出比原始 ABE8e 更高的精度，具有近端移位的原型間隔子相鄰基序 (PAM) 編輯窗口 (A3-A15)，并且編輯效率與 8e-SaCas9-KKH 相當(dāng)。sABE 能夠在單個(gè)腺相關(guān)病毒 (AAV) 載體中進(jìn)行體內(nèi)遞送，具有一定的編輯效率。此外，還通過將sABE系統(tǒng)的mRNA和sgRNA顯微注射到受精卵中，成功地編輯了小鼠胚胎的基因組。該研究表明sABE 系統(tǒng)在臨床前應(yīng)用中具有巨大的治療潛力。
研究背景
目前基因治療在如火如荼的進(jìn)行，然而，SpCas9 (1368 aa) 衍生的基因編輯器及其 sgRNA 的大小太大，無法包裝到單個(gè) AAV 載體中以進(jìn)行有效的體內(nèi)遞送。為了克服這一瓶頸，Cas9 衍生的基因編輯器可以通過內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)拆分成兩個(gè)較小的部分。另一種策略是開發(fā)更緊湊的 Cas9。
在最近的研究中，研究人員成功刪除了PE系統(tǒng)中莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH結(jié)構(gòu)域(621 bp)，且不影響prime編輯活性。為了減小 CBE 系統(tǒng)的大小，他們?nèi)コ嗣摪泵?PmCDA1(261 bp)的 DNA 結(jié)合域，并引入了額外的突變以恢復(fù)酶功能。因此通過刪除某些區(qū)域減少載體大小，使載體更適合AAV包裝是一種有吸引力的策略。
項(xiàng)目研究
該項(xiàng)目首先在熒光報(bào)告系統(tǒng)和內(nèi)源性位點(diǎn)中評(píng)估ABE8.17、AnCBE4max和PE中刪除Cas9的不同結(jié)構(gòu)域是否有效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有ABE8.17在報(bào)告系統(tǒng)和內(nèi)源性位點(diǎn)能夠有效的容忍HNH，REC2和RuvCIII的缺失。
進(jìn)一步的通過組合三個(gè)結(jié)構(gòu)域的缺失以及替換TadA8e，開發(fā)出了sABE，它同時(shí)刪除了HNH和REC2結(jié)構(gòu)域。并且能有效編輯HEK293T細(xì)胞和N2a細(xì)胞。
隨后對(duì)sABE進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)編輯效率和SaCas9-ABE8e效率相當(dāng)，并且擴(kuò)大了編輯窗口，提高了精確性。
最后將sABE應(yīng)用于細(xì)胞疾病位點(diǎn)和剪切位點(diǎn)驗(yàn)證，并將sABE AAV包被注射到小鼠體內(nèi)以及小鼠胚胎評(píng)估sABE效率。
該研究由吉林大學(xué)賴良學(xué)教授、李占軍教授團(tuán)隊(duì)完成。錢育強(qiáng)博士、王迪碩士、牛文超博士為共同第一作者。李占軍教授為通訊作者。該工作得到國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助。
吉滿助力
本研究中所用AAV8病毒由吉滿生物提供。 如想了解更多質(zhì)粒構(gòu)建,病毒包裝,穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建,敲除細(xì)胞株,報(bào)告基因檢測等相關(guān)服務(wù)。歡迎訪問吉滿生物官網(wǎng)：zxpdf.cn 免費(fèi)咨詢電話：400-627-9288
DOI: 10.1186/s12915-023-01644-9
來源：課題組供稿
