研究背景
被稱為“兒童腫瘤之王”的神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma,NB)是一種起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，是兒童最常見的顱外惡性腫瘤。神經(jīng)母細(xì)胞瘤占兒童腫瘤的第三位，是威脅兒童生命的主要惡性腫瘤。90%的患者診斷時小于5歲，發(fā)病平均年齡為19個月。該腫瘤早期診斷難、惡性程度高、轉(zhuǎn)移速度快，常規(guī)治療方法的5年生存率僅為10-20%，它可以發(fā)生在交感神經(jīng)系統(tǒng)的任何地方，包括頸上、椎旁和腹腔神經(jīng)節(jié)，其中大多數(shù)主要產(chǎn)生于腎上腺。
PCLAF(PCNA clamp-associated factor)，也稱為PAF15/KIAA0101，PCLAF作為與增殖細(xì)胞核抗原相互作用的蛋白質(zhì)之一，其作用與增殖細(xì)胞核抗原的功能密切相關(guān)。在與DNA模板結(jié)合的過程中，PCLAF可作為增殖細(xì)胞核抗原充當(dāng)DNA聚合酶增量的輔助因子，可以調(diào)節(jié)DNA聚合酶和增殖細(xì)胞核抗原的結(jié)合。此外，PCLAF在大多數(shù)人類癌癥中過表達(dá)，是腫瘤進(jìn)展的主要調(diào)節(jié)因子，包括膽管癌(CHOL)、宮頸癌、鱗狀細(xì)胞癌和宮頸內(nèi)腺癌 、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)、嗜鉻細(xì)胞瘤 、副神經(jīng)節(jié)瘤(PCPG)、肉瘤(SARC)、睪丸胚芽細(xì)胞瘤(TGCT)、胃腺癌(STAD)以及子宮內(nèi)膜癌(UCEC)等。然而，PCLAF在NB中的生物學(xué)功能研究較少。 文獻(xiàn)來源 2022年2月24日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院新華醫(yī)院的武志祥研究團(tuán)隊在Cell Death and Disease發(fā)表了題為PCLAF promotes neuroblastoma G1/S cell cycle progression via the E2F1/PTTG1 axis的文章，闡述了PCLAF在NB中的過度表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，且在敲低PCLAF后抑制了NB細(xì)胞在體內(nèi)和體外的增殖。PCLAF表達(dá)減少后，細(xì)胞周期相關(guān)通路基因在差異表達(dá)中最為顯著。此外，研究發(fā)現(xiàn)PCLAF通過激活E2F1/ PTTG1信號通路加速了NB細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)變。在這項研究中，作者揭示了PCLAF促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展的機制，并指出了PCLAF/E2F1/ PTTG1軸作為NB治療新靶點的可能性。 本研究首次證實了PCLAF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)、臨床意義及功能作用。首先作者在為了確定PCLAF在NB中是否具有潛在的臨床意義，對神經(jīng)母細(xì)胞瘤TMA進(jìn)行了PCLAF免疫組化，發(fā)現(xiàn)PCLAF表達(dá)與NB的臨床分期呈正相關(guān)。同時，多變量分析顯示， PCLAF基因在不同病理類型的NB組織中表達(dá)存在差異，PCLAF基因在NB組織中表達(dá)高提示患者預(yù)后較差。 PCLAF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及作用 高表達(dá)的PCLAF與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，作者探索了PCLAF是否能抑制成NB的增殖，通過評估PCLAF在5種NB細(xì)胞系(SK-N-BE(2)、SK-N-AS、SH-SY5Y、SK-N-SH和IMR32)中的表達(dá)，檢測了靶向PCLAF的siRNA的沉默效率，發(fā)現(xiàn)PCLAF表達(dá)減少可以抑制成NB的增殖。隨后通過EDU、western blotting和RT-qPCR等技術(shù)證明PCLAF可促進(jìn)NB細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。 PCLAF高表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖 為了探究PCLAF促進(jìn)細(xì)胞增殖的相關(guān)分子機制，作者把與PCLAF相關(guān)的前100個靶基因進(jìn)行了KEGG通路分析，隨后發(fā)現(xiàn)并提出PCLAF通過加速細(xì)胞周期G1/S相變促進(jìn)細(xì)胞增殖的假設(shè)，并用表達(dá)PCLAF特異性短發(fā)夾RNA慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的SKN-BE(2)和SH-SY5Y細(xì)胞系，結(jié)果表明PCLAF在NB細(xì)胞周期進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。減少SK-N-BE PCLAF的表達(dá)和SH-SY5Y細(xì)胞株可以增加細(xì)胞的百分比在細(xì)胞周期G1期，進(jìn)一步說明PCLAF高表達(dá)可促進(jìn)NB的增殖和G1/S細(xì)胞周期過渡。 在RNA-seq數(shù)據(jù)中，PCLAF觸發(fā)與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的通路 基于以上結(jié)果，作者進(jìn)一步分析細(xì)胞周期信號通路，通過RNA-seq的結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCLAF表達(dá)下調(diào)后PTTG mRNA水平下降最為明顯。于是通過western blotting和TMA分析臨床組織樣本，發(fā)現(xiàn)PCLAF與PTTG1顯著相關(guān)，并且證實了PCLAF可以促進(jìn)PTTG1的表達(dá)。隨后作者在NB細(xì)胞中敲除PTTG1后，發(fā)現(xiàn)處于G1期的細(xì)胞數(shù)量也顯著增加。通過兩個方面的結(jié)果證實，PCLAF可以調(diào)節(jié)PTTG1的表達(dá)，促進(jìn)G1/S細(xì)胞周期過渡。 PCLAF通過轉(zhuǎn)錄因子E2F1調(diào)控PTTG1 在證明PCLAF可以上調(diào)PTTG1的表達(dá)后，作者又發(fā)現(xiàn)E2F1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)可以降低PTTG1的蛋白和mRNA水平，這說明E2F1可以通過結(jié)合PTTG1的啟動子來改變PTTG1在NB中的表達(dá)。通過驗證和對照實驗，表明E2F1的確負(fù)責(zé)pclaf介導(dǎo)的PTTG1的激活。 (PCLAF可通過調(diào)節(jié)PTTG1促進(jìn)G1/S細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變) (PCLAF通過轉(zhuǎn)錄因子E2F1調(diào)控PTTG1) PCLAF下調(diào)可抑制體內(nèi)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生長體外實驗 PCLAF可促進(jìn)NB細(xì)胞增殖。因此，為了進(jìn)一步研究PCLAF在體內(nèi)的作用，作者建立了裸鼠皮下異種移植模型。研究表明，PCLAF可促進(jìn)體內(nèi)NB的增殖和生長。 綜上所述，PCLAF與各種不良的臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，是神經(jīng)母細(xì)胞瘤的一個潛在的預(yù)后指標(biāo)。本研究表明PCLAF可以通過E2F1調(diào)節(jié)PTTG1的表達(dá)水平，促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖。這為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的研究提供了新的視角，同時也并為靶向PCLAF的新抗腫瘤治療藥物的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。 吉滿助力 本研究中過表達(dá)及干擾慢病毒均由吉滿生物(Genomeditech)提供。 了解更多質(zhì)粒構(gòu)建,病毒包裝,穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建,敲除細(xì)胞株,報告基因檢測等相關(guān)服務(wù)。 歡迎訪問吉滿生物官方網(wǎng)站：zxpdf.cn
