研究背景
乳腺癌干細(xì)胞（BCSCs）具有自我更新和長(zhǎng)期保持乳腺腫瘤能力，是乳腺腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥性的根源。鐵死亡是一種細(xì)胞死亡的非凋亡性形式，由鐵依賴的脂質(zhì)過氧化作用驅(qū)動(dòng)，并與氧化還原平衡的擾動(dòng)有關(guān)。CSCs對(duì)鐵死亡非常敏感，然而BCSCs中鐵死亡的信號(hào)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。NRF2作為氧化還原動(dòng)態(tài)平衡的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和對(duì)治療的抵抗，對(duì)于NRF2轉(zhuǎn)錄活性的表觀遺傳調(diào)控研究較少。
ZMYND，一種組蛋白表觀遺傳修飾“閱讀器”，可識(shí)別組蛋白H4的乙酰賴氨酸16(H4K16ac)，與HIF-1/2α、BRD4和P-TEFb復(fù)合體協(xié)同激活下游基因。最新研究表明ZMYND8在維持BCSCs和引發(fā)乳腺腫瘤中發(fā)揮重要作用。基于上述，本研究中進(jìn)一步揭示了ZMYND8通過激活NRF2保護(hù)乳腺癌干細(xì)胞抗氧化應(yīng)激和鐵死亡的影響。
文獻(xiàn)來源
美國(guó)得克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心羅偉波團(tuán)隊(duì)在Journal of Clinical Investigation上發(fā)表題為ZMYND8 protects breast cancer stem cells against oxidative stress and ferroptosis through activation of NRF2的研究論文。
研究發(fā)現(xiàn)ZMYND8在體外和體內(nèi)均可以減輕BCSCs的氧化應(yīng)激和鐵死亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。機(jī)制上ZMYND8增加了NRF2蛋白的穩(wěn)定性，并與NRF2物理結(jié)合，增強(qiáng)了BCSCs中NRF2依賴的抗氧化基因的表達(dá)。
項(xiàng)目研究
ZMYND8誘導(dǎo)的抗氧化防御機(jī)制保護(hù)BCSCs抗鐵死亡的模型如下：
一方面，ZMYND8通過抑制KEAP1的表達(dá)而促進(jìn)NRF2蛋白的穩(wěn)定性；
另一方面，ZMYND8通過PBP結(jié)構(gòu)域與NRF2的Neh1結(jié)構(gòu)域直接相互作用將NRF2招募至細(xì)胞抗氧化基因的啟動(dòng)子區(qū)以增強(qiáng)NRF2的轉(zhuǎn)錄因子活性。而NRF2反過來又可以通過ZMYND8啟動(dòng)子區(qū)的抗氧化反應(yīng)元件增加ZMYND8的轉(zhuǎn)錄。
作者使用ROS探針檢測(cè)了細(xì)胞中ROS水平，發(fā)現(xiàn)ZMYND8 KO MDA-MB-231乳腺球中ROS顯著增加，過表達(dá)則降低了ROS水平。隨后，研究人員用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了ALDH高表達(dá)（ALDHhi）BCSCs的ROS水平，發(fā)現(xiàn)ZMYND可以降低ALDHhi BCSCs中的ROS，而且從敲除ZMYND8的4T1細(xì)胞同種異體移植瘤中分離的ALDHhi BCSCs中ROS水平也出現(xiàn)增加。這些結(jié)果表明，ZMYND8是ALDHhi BCSCs中ROS的負(fù)調(diào)控因子。
Fig.1 ZMYND8降低ALDHhi BCSCs的氧化應(yīng)激
ZMYND8 KO抑制了MDA-MB-231乳腺球的形成和自我更新，而抗氧化劑（NAC和GSH-EE）部分阻止了ZMYND8 KO導(dǎo)致的BCSC干性喪失。
接下來，研究人員將ZMYND8 KO MDA-MB-231細(xì)胞原位接種于雌性小鼠乳房脂肪墊內(nèi)，給予NAC組顯著恢復(fù)了小鼠ZMYND8-KO腫瘤的發(fā)生率。綜上所述，ZMYND8在體外和體內(nèi)通過降低ROS來維持ALDHhi BCSCs的干性。
Fig.2 ZMYND8通過減少ROS促進(jìn)ALDHhi BCSCs干性維持
使用鐵死亡抑制劑、細(xì)胞凋亡抑制因子和PAR1依賴性細(xì)胞死亡抑制劑處理ZMYND8 KO MDA-MB-231細(xì)胞，鐵死亡抑制劑部分阻止了ZMYND8 KO導(dǎo)致的MDA-MB-231乳腺球和ALDHhi BCSCs的丟失。
隨后研究人員測(cè)定了細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)ZMYND8 KO顯著增加了Fe2+水平，并誘導(dǎo)了脂質(zhì)過氧化。上述結(jié)果表明，ZMYND8通過抑制鐵死亡維持ALDHhi BCSCs的干性。
Fig.3 ZMYND8可抑制ALDHhi BCSCs的鐵死亡
與ZMYND8一致，NRF2也在ALDHhi BCSCs中上調(diào)，NRF2 KO顯著減少了MDA-MB-231乳腺球的形成，增加ROS和脂質(zhì)過氧化。同樣，F(xiàn)errostatin-1也能部分挽救NRF2 KO導(dǎo)致的乳腺球減少。限制稀釋試驗(yàn)結(jié)果表明，NRF2 KO抑制了NSG小鼠體內(nèi)腫瘤的發(fā)生。研究人員敲除了ZMYND8-OE-MDA MB-231細(xì)胞中的NRF2，結(jié)果表明NRF2 KO可以抑制ZMYND8過表達(dá)對(duì)ROS水平的調(diào)節(jié)。綜上所述，ZMYND8依賴于NRF2以清除BCSCs中的ROS。
Fig.4 ZMYND8依賴于NRF2以抑制鐵死亡
為了研究ZMYND8在BCSCs細(xì)胞中增強(qiáng)NRF2活化的機(jī)制。首先評(píng)估ZMYND8是否與NRF2相互作用。Co-IP結(jié)果證明了NRF2與ZMYND8存在相互作用。
通過構(gòu)建ZMYND8截短體質(zhì)粒，證明了ZMYND8通過PBP結(jié)構(gòu)域與NRF2相互作用。同理，驗(yàn)證可得NRF2的Neh1結(jié)構(gòu)域是與ZMYND8相互作用所必需的。GST-pulldown結(jié)果表明，ZMYND8的PBP結(jié)構(gòu)域與NRF2的Neh1結(jié)構(gòu)域直接相互作用。
Fig.5 ZMYND8與NRF2直接相互作用
熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，ZMYND8過表達(dá)明顯增加了NRF2的轉(zhuǎn)錄活性，ZMYND8 KO在體內(nèi)和體外均顯著降低了NRF2下游抗氧化基因的表達(dá)，說明ZMYND8增強(qiáng)了依賴于NRF2的抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。
人類乳腺腫瘤基因相關(guān)性分析表明，ZMYND8 mRNA與乳腺腫瘤中谷胱甘肽代謝的基因及抗氧化基因呈正相關(guān)。綜上所述，ZMYND8增強(qiáng)了NRF2的轉(zhuǎn)錄活性，從而導(dǎo)致BCSCs中抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。
Fig.6 ZMYND8可增強(qiáng)NRF2的轉(zhuǎn)錄活性
為確定ZMYND8是否協(xié)同激活NRF2下游的抗氧化基因，進(jìn)行了ChIP Seq分析。對(duì)照組中，ZMYND8和NRF2在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近高度富集，且二者ChIP-Seq峰出現(xiàn)重疊。對(duì)ZMYND8 ChIP-Seq峰的基序分析表明，ARE基序明顯富集。ZMYND8 KO顯著降低了NRF2和ZMYND8在NRF2下游的抗氧化基因上的富集。這些結(jié)果表明，ZMYND8將NRF2招募到抗氧化基因的AREs上，從而介導(dǎo)BCSCs中的基因轉(zhuǎn)錄。
Fig.7 ZMYND8將NRF2招募至抗氧化基因的啟動(dòng)子
ZMYND8 KO降低了MDA-MB-231中的NRF2蛋白水平，而MG132可以阻止ZMYND8 KO 導(dǎo)致的NRF2蛋白減少，這表明ZMYND8增加了乳腺癌細(xì)胞中NRF2蛋白的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，ZMYND8 KO誘導(dǎo)KEAP1蛋白表達(dá)，在mRNA水平也觀察到ZMYND8對(duì)KEAP1的負(fù)調(diào)控作用。上述結(jié)果表明，ZMYND8通過其表觀遺傳活性抑制了KEAP1的轉(zhuǎn)錄，提升了NRF2蛋白的穩(wěn)定性。
Fig.8 ZMYND8通過抑制KEAP1增加NRF2蛋白的穩(wěn)定性
研究人員發(fā)現(xiàn)，ZMYND8和NFE2L2的mRNA水平在多種癌癥中呈正相關(guān)，NRF2 KO乳腺癌細(xì)胞中ZMYND8的mRNA和蛋白水平均有降低。這說明NRF2是ZMYND8的上游調(diào)節(jié)因子。
ChIP-Seq結(jié)果表明，在ZMYND8啟動(dòng)子處有強(qiáng)大的NRF2結(jié)合峰，并且NRF2結(jié)合區(qū)內(nèi)存在一個(gè)假定的ARE。報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，NRF2 過表達(dá)顯著提高了ZMYND8 ARE報(bào)告活性。這些結(jié)果說明，NRF2通過結(jié)合ZMYND8啟動(dòng)子上的ARE激活ZMYND8的轉(zhuǎn)錄。
Fig.9 ZMYND8是NRF2的直接靶基因
研究結(jié)論
綜上所述，ZMYND8和NRF2在ALDHhi BCSCs中被誘導(dǎo)，并共同作用抑制BCSCs的鐵死亡，誘導(dǎo)小鼠乳腺腫瘤的發(fā)生。ZMYND8是NRF2的直接靶基因，并通過正反饋機(jī)制，放大NRF2的活化功能，保護(hù)ALDHhi BCSCs免受氧化應(yīng)激和鐵死亡的影響。
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