背景簡介
1963年，Christian de Duve首次提出了自噬（Autophagy）的概念，該詞源自希臘語：“auto”表示自我，“phagy”表示進食，合起來就是“自己吃自己”的意思。
自噬是真核細胞通過形成雙層膜的自噬體包裹并降解自身細胞質成分（如蛋白質、細胞器）的過程，是一種細胞自我保護機制。
在生理條件下，細胞自噬活性通常較低。但在饑餓、缺氧和疾病等刺激下會顯著上調。另外，自噬抑制也與某些疾病相關，如癌癥、神經退行性疾病等。
完整的自噬發(fā)生過程包括自噬啟動、自噬體形成、自噬溶酶體形成，降解及再利用。自噬過程是由大量蛋白質和蛋白質復合物所控制的，每種蛋白質負責調控自噬體啟動與形成的不同階段，具有重要的生理功能，并和腫瘤，神經退行性疾病等密切相關。
自噬相關蛋白
在自噬的發(fā)生過程中，有多種自噬相關蛋白可調節(jié)和控制自噬形成的不同階段。
迄今為止，科學家已在酵母中鑒定出40余個編碼ATG蛋白的基因，并且大多數在酵母和哺乳動物之間高度保守。在哺乳動物細胞中，饑餓誘導的自噬大約受20種核心ATG基因調節(jié)，它們在液泡附近被不斷募集，并組裝形成自噬前體。
常見的自噬檢測方法
01 透射電鏡法
自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，直接在透射電鏡下觀察自噬不同階段的形態(tài)變化是一種非常直接的方法。
自噬經歷了三個階段：吞噬泡(phagophore)-自噬小體(autophagosome)-自噬溶酶體(autolysosome)。
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02 LC3熒光標記檢測法
LC3全稱MAP1LC3，它貫穿整個自噬過程。
哺乳動物的LC3可分為三種：LC3A、LC3B和LC3C。自噬發(fā)生時，LC3 蛋白合成后立即在其羧基端被 Atg4 所剪切，產生細胞漿定位的 LC3-I。
在自噬過程中，LC3-I 會被包括 Atg7 和 Atg3 在內的泛素樣體系所修飾和加工，產生分子量為14kD的 LC3-II，并定位到自噬小體中。自噬體和溶酶體融合后，外膜上的LC3-II被ATG4切割，產生LC3-I循環(huán)利用。LC3-II 的含量和發(fā)生自噬的程度成正比，LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。
得益于熒光蛋白技術的發(fā)展，我們可以通過熒光蛋白標記的方式，直觀的看到自噬現象和過程。
LC3雙熒光標記法
圖示：構建mRFP-GFP-LC3雙熒光標記系統，使用紅色熒光蛋白mRFP來標記及追蹤LC3，用綠色熒光蛋白GFP指示自噬溶酶體。因為GFP對酸性環(huán)境敏感，自噬溶酶體呈酸性，一旦自噬溶酶體形成，GFP就會發(fā)生淬滅，此時只能觀察到紅色熒光。因此，GFP的減弱表明溶酶體與自噬小體融合形成了自噬溶酶體。而mRFP是一直穩(wěn)定表達的，因而可以通過GFP與mRFP的亮點比例來評價自噬流進程。
吉滿自主研發(fā)的雙熒光自噬標記自噬產品，可用于標記及追蹤LC3以及自噬流的變化 →自噬研究工具 | LC3自噬慢病毒實驗原理及應用
LC3單熒光標記法
圖示：利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的原理，構建綠色熒光蛋白GFP-LC3融合蛋白，當細胞內沒有自噬發(fā)生時，GFP-LC3融合蛋白會均勻地分散在細胞質中，一旦細胞內出現自噬活動，GFP-LC3融合蛋白就會聚集并轉位到自噬體膜，此時在熒光顯微鏡下可清晰地觀察到明亮的綠色斑點。斑點數量的多少就代表了自噬活動的強弱。
吉滿自主研發(fā)出單熒光標記的自噬指示產品，可以通過計數評價自噬活性的高低！
03 WB檢測
1、利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化評價自噬形成。自噬形成時，胞漿型LC3-I會酶解掉一小段多肽，隨后跟PE結合轉變?yōu)槟ば偷腖C3-II。
2、利用Western Blot檢測p62蛋白的表達量也可以評價自噬水平。在自噬體形成過程中，p62作為鏈接LC3和聚泛素化蛋白之間的橋梁，被選擇性地包裹進自噬體，之后被自噬溶酶體中的蛋白水解酶將其降解，所以p62蛋白的表達量與自噬活性呈現負相關。
自噬檢測方法對比
自噬研究具有廣泛的生物學和醫(yī)學意義，有助于揭示細胞的基本生理過程，理解疾病機制，發(fā)展新的治療策略，以及促進人類健康和長壽。
吉滿生物可提供一系列細胞自噬研究工具和服務，包括自噬細胞株構建、自噬基因過表達及干擾、自噬誘導劑/抑制劑、自噬信號通路研究等！
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